本发明公开了一种包载miRNA‑204‑5p的外泌体及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域，通过构建稳定过表达抑癌基因miRNA‑204‑5p的稳转株细胞，分离及富集包载miRNA‑204‑5p的外泌体，以外泌体作为miRNA‑204‑5p的药物传递系统，发挥其对肿瘤的治疗作用。本发明提供的包载miRNA‑204‑5p的外泌体，显著提高与肿瘤细胞的相容性，能够高效将miRNA‑204‑5p释放进入肿瘤细胞内，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，显著抑制肿瘤细胞的增殖。通过模拟体内情况，优选操作过程中使用的试剂种类、质量或者浓度等参数，在细胞内将miRNA‑204‑5p自然装载到外泌体中，显著提高miRNA‑204‑5p与外泌体在细胞内的包载效率，降低包载过程中的风险，制备的外泌体更具有稳定性、安全性和高效性。