本发明涉及一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，包括以下步骤：用平衡缓冲溶液平衡模拟流动床的色谱层析柱；将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中可同时对色谱层析柱进行抗原样品杂质清洗及样品解吸洗脱，色谱填料的清洗再生及平衡液平衡，在连续解吸洗脱过程中收集纯化后的样品。本发明首次将模拟流动床应用于FMD灭活病毒抗原的分离纯化，可实现连续饱和上样分离操作，大大提高了上样量；且通过多个单体柱连续分离纯化，连续化程度高，大大缩短了分离纯化时间，提高了制备效率，降低了运行成本。且本发明特定的选择刚性填料，使其填料载量即耐压性大幅提高，减少了色谱填料的使用量，延长了模拟流动床中色谱柱的使用寿命。