本发明公开了一种高纯度缬草三酯的制备工艺，本发明包括三部分，第一部分、采用超临界CO2萃取蜘蛛香中的挥发油与非挥发性成分，同时解析到不同分离罐，实现初级分离；第二部分、采用柱层析法纯化，用不定型正相硅胶作固定相，乙酸乙酯和石油醚(V : V=15 : 85)作流动相洗脱，连续两次洗脱可以得到HPLC纯度91%的缬草酸酯，室温下呈淡黄色油液，相对浸膏收率18.6%。第三部分、结构表征，经NMR和MS表征，并与已知波普数据对比，确定是4‑(乙酰氧甲基)‑6, 7‑二氢‑1H‑螺[环戊烷[c]吡喃‑7, 2' ‑环氧乙烷]‑1, 6‑双‑3‑缬草酸酯，CAS NO.18296‑44‑1。该工艺提取效率高，提取过程中目标物不被破坏，纯化方法简单，损失小，得到的缬草三酯纯度较高，为后续药理及活性研究提供可靠的原料保障。