本发明公开了一种用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，包括：a将纯化血红蛋白后的阴离子交换层析柱的进出液口调整；b用去离子水清洗所述层析柱，去掉所述层析柱在使用后残留的洗脱液，然后用酸性水溶液清洗所述层析柱；c用去离子水清洗所述层析柱洗掉草酸，然后用含有Trion X‑100和乙二胺四乙酸的水溶液清洗所述层析柱，该水溶液的PH值为4.3‑5.5；d用去离子水清洗所述层析柱，洗掉Trion X‑100和乙二胺四乙酸。本发明用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法，可快速去除纯化血红蛋白后残留在层析柱中的杂质，节省批间操作时间，延长填料使用寿命，降低成本并保证纯化产品质量。