本发明提供一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料及其制备方法，通过采用脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基磺酸钠以合适的比例混合，对皮肤进行脱脂后，采用合适比例的Dispase与Trypsin‑EDTA复合酶对皮肤进行脱细胞处理后，浸泡于羧甲基壳聚糖、透明质酸、羟乙基纤维素、氯化钙和硫酸角质素混合溶液并以氧化海藻酸钠进行交联反应，基于脱脂率高且保持了原有皮肤胶原的含量的特点，并配合羧甲基壳聚糖、透明质酸、羟乙基纤维素、氯化钙和硫酸角质素的联合协效作用，制备得到的复合型脱细胞真皮基质生物敷料，具有良好的抗菌、促愈合的功效，且该敷料能同时兼具良好的机械性能，易于平铺敷于伤口表面，不易破损。