本发明提供了一种高纯度盐酸万古霉素的分离纯化方法，所述方法包括下列步骤：(1)万古霉素粗品通过离子交换层析法得到盐酸万古霉素溶液，并通过纳滤脱盐浓缩得到浓缩液；(2)先用盐酸溶液调节浓缩液，再将调节后的浓缩液通过反相色谱层析柱进行柱层析；(3)收集万古霉素B的层析液以得到混合层析液；(4)用盐酸调节混合层析液，然后经过纳滤浓缩脱除溶剂和盐，以得到浓缩液；(5)进行脱水干燥步骤(4)的浓缩液，或者通过溶剂结晶或盐析法结晶以得到色谱纯度达到99%，外观纯白的盐酸万古霉素粉。本发明的方法不仅提高了产品品质，而且适合于扩大的商业化生产。