本发明涉及正相色谱法分离磷酸奥司他韦及其对映异构体的高效液相色谱方法，该方法采用硅胶表面涂敷有纤维素‑三(3, 5‑二氯苯基氨基甲酸酯)柱，流动相为正己烷‑无水乙醇‑甲醇‑三氟乙酸‑二乙胺体积比为(90 : 8 : 2 : 0.4 : 0.2)，柱温30℃~40℃，检测波长为240nm，流速为每分钟0.9~1.1ml。该方法能分离磷酸奥司他韦与磷酸奥司他韦对映异构体，且简单准确、灵敏度高，可用于磷酸奥司他韦生产中对映异构体的检测。