本发明公开了一种用于测定高密度脂蛋白胆固醇的试纸，试纸包括红细胞分离层、辅助分离层和反应层，红细胞分离层、辅助分离层和反应层是分离材料、分离膜和反应膜依次经过红细胞分离液、辅助分离液和反应液浸渍后干燥制得，红细胞分离液包括如下组分：缓冲盐、二价金属离子、分子量为30000～500000的硫酸葡聚糖钠盐、血凝素或Anti‑RBC抗体；辅助分离液包括如下组分：缓冲盐、表面活性剂I和多元醇；反应液包括如下组分：缓冲盐、表面活性剂II、多糖、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、氧化性物质和显色剂；该试纸能简单、快速的检测高密度脂蛋白胆固醇的含量。本发明还提供了该试纸的制备方法和应用。