本发明属于医药生物技术领域，特别是涉及一种可制备高纯度天然熊去氧胆酸的分离纯化工艺。高纯度天然熊去氧胆酸由人工引流熊胆制备的熊胆粉分离纯化所得，高效液相色谱纯度不低于98％。其制备方法是：首先应用阳离子交换介质分离纯化制备纯度不低于90％的牛磺熊去氧胆酸，然后将牛磺熊去氧胆酸在碱性条件下彻底水解为熊去氧胆酸和牛磺酸，再应用硅胶吸附色谱技术分离纯化制备纯度不低于98％的熊去氧胆酸。本发明制得的天然熊去氧胆酸具有治疗原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎作用。