本发明属于生物分析领域，具体涉及一种液质联用定量检测人血清中替诺福韦浓度的方法。本发明以氘代替诺福韦为内标物，采用Inertsil C8‑3柱以乙腈和甲酸水溶液为混合流动相进行梯度洗脱，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中替诺福韦浓度的重现性、准确度均较好。本发明方法可用于评价替诺福韦各剂型的生物等效性。