一种检测人ABO血型试纸条、制备方法、检测方法及应用，生物医药领域，包括聚酯板以及与聚酯板上边缘粘结的吸水纸，在聚酯板上表面沿层析方向依次铺设有样品垫和预先包被好抗A、抗B和抗RBC的硝酸纤维素膜，且硝酸纤维素膜的上边缘与吸水纸的下边缘搭接，样品垫上铺设有溶血剂和细胞膜荧光染料。本发明提供一种检测人ABO血型试纸条的制备方法，通过该制备方法能制备出血型检测配套试剂不需低温保存，操作简单，灵敏度高的试纸条。此外，还提供一种检测人ABO血型的试纸条，该试纸条可以在短时间内完成多个抗原项目的联合检测，操作简便快捷，对操作人员专业技术水平要求低，适合于临床检测，快速获得检测结果。