本发明属于病原分子检测领域，涉及一种铜绿假单胞菌的环介导等温扩增引物、试剂盒及其检测方法。所述引物包含根据该菌特异性基因PAK的序列的六个区域设计三对特异引物。所述检测方法其步骤包括：引物设计；铜绿假单胞菌总DNA提取；环介导等温扩增反应；环介导等温扩增反应产物分析：若扩增产物变为蓝绿色则为铜绿假单胞菌阳性，若扩增产物为黄褐色则为铜绿假单胞菌阴性。所述试剂盒包含上述引物，以及DNA快速提取试剂、阴性对照品、阳性对照品、显色试剂、Bst DNA聚合酶、反应液等成分。本发明灵敏度高，检测下限为10个拷贝的阳性质粒；检测速率高，仅需1小时即可得到结果；实用性高，不需要昂贵的精密仪器。