本发明公开了一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR‑T转基因载体，包括：用于质粒复制的原核复制子pUC Ori序列；用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40 Ori序列；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；用于真核细胞表达绿色荧光的ZsGreen1绿色荧光蛋白；用于共同转录表达蛋白质的IRES核糖体结合序列；用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人EF1α启动子；用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体；用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件。此外，还公开了该载体的构建方法和应用。本发明能显著提高细胞因子的分泌、CAR‑T细胞的体外杀伤作用，且临床治疗效果突出。