一种检测细胞色素氧化酶CYP3A4的双光子荧光探针的应用，其属于生物医药技术领域。该特异性探针底物可用于测定生物体系中CYP3A4的酶活性。CYP3A4酶活性测定的流程如下：选择萘酰亚胺4‑位羟化反应为探针反应，通过定量检测单位时间内其羟化代谢产物的生成量来测定各类生物样品中CYP3A4酶的活性。本发明可用于不同种属、不同个体来源生物样本中CYP3A4酶活的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中CYP3A4活力定量测定，以期实现对重要药物代谢酶CYP3A4处置药物能力的评估。还可用于体外快速筛选CYP3A4的抑制剂，并评估其抑制能力和肿瘤中CYP3A4活性的检测，能够检测斑马鱼中CYP3A4活性，并用以检测CYP3A4在活体层面药药相互作用。