本发明公开了一种广东虫草原生质体制备及复苏方法。所述的制备方法包括菌丝体培养、原生质体制备、原生质体纯化等步骤，采用含有裂解酶和崩溃酶的混合酶体系对广东虫草的菌丝体进行酶解得到广东虫草的原生质体，并利用TB3复苏培养基对广东虫草原生质体进行复苏。本发明首次建立了广东虫草原生质体制备及复苏体系，有利于广东虫草的后期遗传转化研究或原生质体融合等技术的实施，加快其遗传及育种等方面的研究速度，有助于推进其在保健食品和医药领域的研究应用进度，造福于社会。