本发明提供了一种血浆中硝酸异山梨酯、5‑单硝酸异山梨酯和2‑单硝酸异山梨酯的检测分析方法，该方法通过采取一步有机溶液萃取、选取合适的色谱柱长、以及用醋酸根加合离子作为母离子来建立检测通道，优化了参数组合，最终成功制定出能同时测定硝酸异山梨酯、2‑单硝酸异山梨酯和5‑单硝酸异山梨酯的LC‑MS/MS方法。本发明所述检测分析方法具有快速、准确、灵敏度高、操作简便等优点，实现硝酸异山梨酯、5‑单硝酸异山梨酯和2‑单硝酸异山梨酯的血药浓度同时测定。