本发明提供了一种测定康布斯汀及其代谢产物的方法，该方法包括如下步骤：对待检样品进行液‑质联用分析；其中在高效液相色谱仪中，使用包含乙酸铵及甲酸的流动相；以及在质谱分析时，采用ESI(+)电离模式下，MRM模式测定CA4P、CA4的[M+H]+峰，及CA4G的[M+NH4]+峰。本发明的测定康布斯汀及其代谢产物的方法，使采用单一质谱扫描模式一同检测CA4P、CA4及CA4G成为可能，且分析过程无需进行质谱正负离子扫描模式的切换，具有特异、灵敏、简便、重现性好等特点。