本发明涉及一种耐高浓度苯酚、重金属和耐低温红球菌分离方法，该方法包括：将菌种，放入LB液体培养基中富集培养，经序批式运行方法进行低、中、高三个苯酚浓度梯度的高浓度苯酚降解、耐受高浓度重金属功能菌的驯化，驯化后，对菌种的分离纯化，得到的纯菌株深红红球菌。本发明所述方法，可以缩短了高浓度苯酚降解、耐受高浓度重金属功能菌株的驯化和分离周期，且菌株生长繁殖快、耐受苯酚和重金属能力强，易于形成优势菌。采用本发明所述方法得到的菌株处理高含苯酚和重金属废水时，具有一体化程度高、工艺流程简洁、运行管理难度低等优点，有助于解决高浓度苯酚和重金属废水生物脱酚的难题。