一种采用高效液相色谱法检测维生素C二步发酵法的发酵液中葡萄糖酸含量的方法，采用如下色谱条件：氨基色谱柱，紫外检测器，流动相为体积比为40 : 60～60 : 40的磷酸盐缓冲溶液与乙腈混合液，其中磷酸盐缓冲溶液浓度为1～4‰，流速0.5～1.5ml/min，柱温20～40℃，检测波长205～215nm，进样量20μl。具有重现性强、灵敏度高、准确度高等优点，可快速、准确地测定维生素C发酵液中葡萄糖酸的含量，为提高“二步发酵法”维生素C生产工艺发酵收率的研究提供指导。