本发明公开了一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法，包括以下几个步骤：步骤一，多肽衍生化处理：将含多个手性中心的多肽溶于稀释剂中，依次加入缓冲溶液和衍生化试剂，放置暗处60℃水浴反应60min，获得多肽手性异构体衍生化物；步骤二，分离检测：采用高效液相色谱法对多肽手性异构体衍生化物进行分离和检测。本发明具有快速高效分离检测出含两个及以上手性中心的多肽手性异构体，操作方法简单，分离度高，灵敏度强等优点。