本发明涉及一种区分滑液囊支原体野毒株和疫苗株MS‑H的实时荧光定量PCR试剂盒，试剂盒含有：序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示的PCR引物，序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的探针，所述探针的5’端分别标记有FAM和VIC报告基团，3’端均标记有MGB荧光淬灭基团。经过体外实验证明本发明的试剂盒敏感性高、特异型强、重复性好，能准确区分MS温度敏感型疫苗株(MS‑H株)和MS野毒株，既可用于对已经经过分离培养并纯化的MS分离株进行鉴别，也可用于免疫鸡群MS‑H疫苗株在鸡体内的复制效率评估与野毒感染的监测。