本发明涉及一种葡萄酵素的制备方法，包括如下步骤：步骤S1：将葡萄打碎，置入发酵容器中；步骤S2：加入糖；步骤S3：加入纯净水；步骤S4：加入混合益生菌，厌氧发酵；步骤S5：发酵完成后于无菌条件下过滤；步骤S6：初检合格后，于无菌条件下灌装，检验、产出成品；其中，所述步骤S2中，所加入的益生菌包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌及双歧杆菌。本发明提供的葡萄酵素的制备方法，通过发酵菌种的选择及厌氧发酵环境的控制，缩短了发酵工艺，增加了成品酸碱度值，控制了发酵过程中的杂菌，提高了所制备的酵素的营养价值。