本发明公开了一种分离检测白术内酯Ⅱ和白术内酯V的HPLC方法，以十八烷基硅烷键合硅胶(碳十八)为固定相，以含有三氟乙酸的有机溶剂水溶液为流动相；具体地，所述有机溶剂水溶液为乙腈体积百分浓度34‑38％的乙腈水溶液，含有体积百分浓度2.5‑4.5％的三氟乙酸，或所述有机溶剂水溶液为甲醇体积百分浓度47‑51％的甲醇水溶液，含有体积百分浓度2‑4％的三氟乙酸。本发明提供的HPLC方法可以有效将白术内酯Ⅱ和白术内酯V进行分离，分离度大于1.5，符合规定；该方法仅需使用普通的碳十八色谱柱和普通的有机溶剂，且无需梯度洗脱，重复性高，易于在不同实验室转移。