本发明公开了一种利用毕赤酵母高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法，属于基因工程领域。本发明成功实现了Sortase A在毕赤酵母中的高效分泌表达，解决了目前已有报道中该酶在大肠杆菌胞内表达中存在的产率较低、菌体需要破壁和菌株不稳定的问题。经过表达策略的筛选和发酵条件优化，胞外Sortase A的酶活和浓度分别可达131.9U/mL和97.8mg/L。本发明通过实现Sortase A的高效分泌表达，为该酶的工业化生产及其在蛋白质工程领域的应用打下了基础。