本发明公开了一种猪睾丸间质祖细胞PLCs的长期培养方法，其中包括体外分离、检测和分化，利用猪PLCs的体外增殖培养基培养仔猪睾丸成纤维细胞5～8天后，得到PLCs克隆集落；利用猪PLCs的分化培养基进行培养后，第3天PLCs开始向成熟睾丸间质细胞分化，然而在增殖培养基中培养，在体外最长维持时间达到了6个月。本发明首次建立起一套成熟的猪PLCs的分离、培养、检测和分化的完善方法，最终确立的不同体外培养体系可以实现控制PLCs在体外维持增殖和分化。本发明的方法对于体外研究PLCs生物学性质，以及药物研发和疫苗生产等方面应用具有潜在应用价值。