本发明提供一种真空循环臭氧的高效灭菌方法，步骤如下：使检品内部的部分沉睡细菌激活或孢子发芽；将干燥检品倒入灭菌滚桶内，密闭加热并抽真空消除检品孔隙内空气和湿气；将臭氧气体加湿加压后，导入控温缓冲桶冷却到25±2℃，并冷凝多余水气；将饱含水气的高压臭氧灌满灭菌滚桶，旋转灭菌，同时在灭菌滚桶的另一侧以低于进气的速率排出灭菌后的臭氧气体，维持灭菌滚桶压力在1.1‑5atm，并让排出的臭氧气体经过冷凝干燥之后，再次进入臭氧制造机，循环制造更高浓度的臭氧气体，并再次进入灭菌滚桶，持续循环灭菌15‑120分钟，直至灭菌结束。本发明的臭氧可进入检品每一面的微小孔隙内进行全面性的灭菌，且灭菌效率高，效果好，适用于片状、颗粒、粉末等多层堆积的检品。