本发明涉及微藻中油脂分离纯化，具体的说是一种采用组合色谱柱层析分离的方法从微藻中制备高纯度的单半乳糖二酰基甘油(MGDG)。本发明以藻粉为原料，提取油脂后经大孔吸附树脂层析柱脱除色素；然后经硅胶层析柱分离获得MGDG粗品；最后经石墨化碳层析柱进一步纯化获得MGDG纯品。该发明同时具有操作简便快速等优点，有利于简化下游加工操作，易于规模化生产，有利于对微藻中生物质综合利用。