本发明提供一种基于点击反应阻断免疫检查点的多肽组合物及其制备方法和应用。所述多肽组合包括靶向单元和组装单元；所述靶向单元包括靶向片段和含炔基的疏水分子，所述靶向片段与含炔基的疏水分子通过酰胺键连接；所述组装单元为叠氮化的组装片段，所述组装片段为具有自组装能力的多肽序列。本发明提供的多肽组合物的靶向单元，可深入到深层肿瘤组织，精准定位癌细胞，多肽组合物的组装单元可以与靶向单元发生高效点击反应而偶联，同时组装单元在肿瘤组织原位自组装构筑多肽纳米纤维，实现免疫检查点的长效阻断，减少免疫逃逸，达到长效的免疫治疗效果。