本发明公开了一种从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法，属于分离纯化技术领域，包括：S1，将食用菌原料烘干然后粉碎过筛，得到干食用菌粉。S2，向所述干食用菌粉中加入提取液，然后静置过滤，提取到脑苷脂B粗品；S3，将所述脑苷脂B粗品用烷烃类溶剂复溶，进行离心处理，将处理后得到的上清取出；S4，使用正相固相萃取柱对所述上清进行纯化，待固相萃取柱上样后，依次使用烷烃类溶剂、所述醚类溶剂、酮类溶剂洗脱；S5，将所述洗脱液使用反相半制备型高效液相，设定纯化参数，按照液相方法进一步纯化所述洗脱液，最终得到纯度为99％以上的脑苷脂B。本发明建立了一种从食用菌中分离纯化脑苷脂B的方法，处理方法简单、重现性好。