本发明公开了一种丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用，所述方法通过由特定家蚕丝素缺失型突变品种的蚕茧提取获得的丝胶蛋白水溶液同时与两种交联剂交联，获得具有新特性的丝胶蛋白水凝胶。由本发明所述方法制得的丝胶蛋白水凝胶具有新的荧光特性，即超强的绿色和红色荧光特性；具有与传统水凝胶不同的微观结构，水凝胶拥有两类微孔的复合孔结构；同时具有形变记忆性，可注射性及原位成胶特性；所述丝胶蛋白水凝胶具有良好的生物相容性和细胞粘附性，对药物具有良好的控释作用；丝胶蛋白水凝胶及其经过冻干得到的三维多孔丝胶蛋白生物支架，可作为细胞外基质支持细胞生长和促进营养物质交换，可应用于多种组织损伤的修复和疾病的治疗。