本发明公开了一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用，所述方法提供在5`端含有限制性内切酶特异性识别序列，并标记有荧光基团和猝灭基团的一对交叉引物、一对置换引物，以及3～6条扩增引物恒温扩增目的基因片段并进行可视化检测、电泳检测、实时浊度检测及实时荧光检测。本方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。