本发明公开了一种荧光素纳米微球洗手液及其制备方法，所述荧光素纳米微球洗手液包括荧光素纳米微球和药学上可接受的载体或助剂，具体包括如下重量百分比的成分：荧光素纳米微球2‑10％，富脂剂0.5‑3.2％，润肤保湿剂65‑90％，黏度调节剂1‑4％。本发明所提供的荧光素纳米微球洗手液所采用的荧光素纳米微球的尺寸大小与细菌或病毒的大小一致，可更好地模仿病原体；其所采用的荧光素纳米微球与单一荧光素相比，荧光强度更强，且敏感度更高；所制得的荧光素纳米微球洗手液在特定波长灯源下检测，根据手中荧光亮度分布判断手消毒效果，提供一种可靠的广为医疗行业采纳的效果检测标准。