本发明公开了一种骨骼肌组织线粒体的提取方法，包括以下步骤：步骤一：取肌肉组织，切成肉糜；步骤二：将肉糜与裂解液混合并匀浆，得匀浆液；步骤三：离心得第一上清液，将第一上清液过滤，得第一滤液，将第一滤液离心，得第二上清液，将第二上清液离心得第一沉淀；步骤四：向步骤三制得的第一沉淀中加入洗涤缓冲液，混匀，离心得第三上清液，再将第三上清液离心得第二沉淀，即得骨骼肌组织线粒体。同时，通过改进裂解液、洗涤缓冲液和保存缓冲液配方，改进匀浆器结构，获得提取率、纯度均较高的骨骼肌线粒体，解决了骨骼肌组织线粒体提取存在的提取率低、杂蛋白含量高，提取效果差的问题。