本发明公开了一种体外诊断试剂瓶用橡胶塞及方法，包括塞盖及由所述塞盖延伸出的塞颈，塞颈沿其周向均匀开设槽，槽之间形成肋，肋由第一橡胶构成，橡胶塞除肋的其他部分由第二橡胶构成。本发明提供的橡胶塞的制备方法，经过混炼、压延、硫化粘接、切边和消毒的工序制备所述的橡胶塞。本发明提供的体外诊断试剂瓶用橡胶塞，第二橡胶构成的橡胶塞部分，能够耐受一定低温。塞劲部的肋由第一橡胶形成，能够增强该部位的结构致密性，减少老化，减少其挥发物，同时增强其对与其接触的体外诊断试剂用瓶口的密封性。