本发明提供一种维生素D代谢物的检测方法，所述方法包括步骤：以有机溶剂萃取血清样品中分析物，即维生素D代谢物；在吹干的萃取剩余物中加入衍生试剂4‑苯基脲唑和二乙酰氧基碘苯以发生狄尔斯阿尔德反应。本发明用液相色谱‑串联质谱法检测维生素D代谢物。该方法成本低，反应时间快，灵敏度高，抗干扰力强。