本发明提供了一种用于制备电泳凝胶柱的自动灌胶生产线、灌胶方法及用途，所述生产线按照灌胶工艺路线包括依次设置的第一层胶灌胶模块、吸水模块和第二层胶灌胶模块。所述方法包括：固定有凝胶玻璃管的灌胶孔板置于所述传送带的卡槽上，开启自动灌胶生产线，进行第一层胶灌胶操作，第一层胶凝固后吸除凝胶胶面上的压胶水，进行第二层胶灌胶操作，待第二层胶凝固后再次吸除凝胶胶面上的压胶水，得到所述的电泳凝胶柱。本发明使用柱塞泵定量泵入两种溶液，在线混合；通过高通量灌胶操作，并对胶面进行后续处理，解决了人工操作过程中产品性能差，合格率低的问题。