本发明公开了一种采用连续离子交换色谱技术分离核苷酸的工艺，RNA酶解液经脱色预处理后，采用三区式两步骤的连续离子交换色谱分离四种5’‑核苷酸UMP、GMP、CMP和AMP。本发明利用四种核苷酸与树脂间的离子交换竞争作用，通过连续装置实现四种核苷酸分离纯化的目的，产品中除UMP外其他核苷酸纯度可达98％以上，UMP纯度为92％～95％，另外，产品中四种核苷酸的平均收率可达到97％以上。