本发明公开了一种EV71‑VP1手足口病多肽疫苗及其制备方法与应用。分离人手足口病病毒，全基因组测序得到EV71病毒VP1结构蛋白，将其分成20组并合成多肽片段。筛选出含EV71病毒抗体血清，通过酶联免疫吸附反应初步筛选出具有较高免疫效果的2号、4号和8号多肽。为进一步验证上述初步筛选的多肽是否在小鼠模型内具有免疫效果，本发明合理设计了Balb/c小鼠试验模型，并对其进行病理切片HE染色病理分析，8号多肽对模型Balb/c小鼠的小肠、骨骼肌和大脑均具有较高的免疫效果，2号多肽对模型Balb/c小鼠的骨骼肌具有较高的免疫效果。通过上述酶联免疫吸附实验及模型Balb/c小鼠的病理检查综合分析和验证，结果表明本发明优选的2号多肽和8号多肽在EV71病毒疫苗开发应用中潜力巨大。