一种β‑内酰胺酶敏感型荧光纳米探针及其制备方法和应用。该纳米探针是以两亲性生物素‑聚乙二醇‑内酰胺‑十八胺为载体材料制备的纳米粒和包载于该聚合物纳米粒中的荧光素香豆素6构成。通过生物素与链霉亲和素琼脂糖珠反应，将纳米探针固定在琼脂糖珠上。当存在β‑内酰胺酶时，内酰胺结构水解，纳米探针解体释放出香豆素6，然后通过检测所产生的荧光强度，结合标准曲线，即可检测样品中β‑内酰胺酶的量，从而达到检测耐药菌的目的。该纳米探针具有制备简单、灵敏度、准确和精密度高，且可显著放大β‑内酰胺酶的信号等优点。