一种羊肚菌菌种保藏方法，包括以下步骤：第一步、制作菌种保藏培养基；取小麦、木屑、麦麸以及贫营养黄土，首先将小麦浸透水后捞出，然后与木屑和麦麸搅拌均匀得到初始培养基，将初始培养基装入培养瓶中，再在初始培养基上铺设滤纸，滤纸上覆盖贫营养黄土，封闭瓶口并进行高压灭菌，取出冷却后得到含菌种培养基的培养瓶；第二步、接种培养；在无菌条件下，将分离提纯的羊肚菌试管种接入由第一步得到的培养瓶当中，直至羊肚菌菌丝在瓶内长满；第三步、菌核培育；第四步、冷冻保藏。本发明克服了羊肚菌试管菌种保藏老化或退化严重的问题，而且菌种保藏量大，能够减少菌种扩繁次数，诱发子实体的形成，可直接用于大田生产。