本发明涉及生物医药工程技术领域，提供了一种于体外长期维持肝细胞功能的培养体系及采用该培养体系进行成熟肝细胞长期体外培养的方法，该培养体系包括如下组分：液体基础培养基、0‑5×B27添加剂、0‑5×N2添加剂、1％青链霉素/链霉素、0‑100mM尼克酰胺、0‑1mM地塞米松、0‑500μg/mL维生素C、0‑10μM Latunculin B、0‑50μM Blebbistatin、0‑50μM Dasatinib、0‑500μM XAV939和0‑10000μM的LY294002。成熟肝细胞长期体外培养的步骤如下：A、预先包被培养支持物并于4℃保存过夜；B、采用含有1％基质胶的培养体系将刚分离肝细胞种植于该培养支持物上，4～6小时后采用含1％基质胶的培养体系换液去除未贴壁细胞，之后每天换液直至第三天，三天后更换为不含基质胶的培养体系换液直至三周。