本发明属于基因工程技术领域，涉及一种制备东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的方法及其应用。该方法包括以下步骤：(1)获取东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；(2)利用所述基因构建pBKPU01‑Bombinin重组表达载体；(3)将所述载体转化到宿主菌中构建工程菌；(4)利用所述工程菌表达所述东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin，获取所述东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin。该方法能够获得大量的东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin。