本发明提供了一种三联疫苗，所述三联灭活疫苗的抗原为灭活的鸡新城疫La Sota病毒株、灭活的H9亚型禽流感QF01株和灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白，还提供其制备方法：I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白经二乙烯亚胺灭活后，与灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液混合乳化后得到三联灭活疫苗。本发明的三联灭活疫苗灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白含量高，免疫原性强，甲醛和内毒素含量低，对当前流行的I群8b型禽腺病毒具有较好的保护效果，安全性能好，免疫效果确实，可以抵抗新城疫病毒、禽流感病毒以及I群8b型禽腺病毒对临床鸡群的感染，持续期长，仅使用一次0.3mL疫苗的情况下，免疫持续期能达到五个月，至少给鸡群提供70%的保护率。