本发明涉及一种兽用无水氯化钙恩诺沙星注射液及其制备方法和应用。所述注射液由复合溶媒、恩诺沙星和无水氯化钙组成；所述复合溶媒包括如下体积分数的组分：丙二醇20～40％，乙醇8～12％，余量为水；所述无水氯化钙与恩诺沙星的质量比1 : 2.5～3.2；所述注射液中恩诺沙星的质量分数为0.5～10％；所述注射液的pH为4.0～6.0。本发明提供的兽用无水氯化钙恩诺沙星注射液可避免恩诺沙星“脱羧”，保留其抗菌活性，而且质量稳定，在5℃以上的室温中放置无析出，给禽畜肌肉注射，注射部位刺激性小，符合兽医药品的有关质量规定；给畜禽肌肉注射后，在体内代谢降解为恩诺沙星和恩诺沙星的代谢物环丙沙星，继续保有抗菌活性。