本发明公开了化合物diaporisoindole A的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明从巴戟天内生真菌Diaporthe lithocarpus A740的固体发酵培养物中制备分离得到化合物diaporisoindole A，其结构式如式(Ⅰ)所示。本发明通过实验发现，diaporisoindole A具有较强的抗肿瘤活性，可以用于制备抗肿瘤药物，为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，同时为开发利用药用植物内生微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。