本发明公开了一种EV71病毒核酸质粒，其中所述EV71病毒核酸质粒包括EV71病毒全长cDNA序列和真核表达质粒序列。本发明还提供了所述EV71病毒核酸质粒的构建方法，该病毒核酸质粒能够在肿瘤细胞中包装出活体病毒并引发肿瘤细胞的凋亡。本发明还提供了所述EV71病毒核酸质粒用于制备抑制实体瘤药物的用途。本发明的EV71病毒核酸质粒通过运载工具能够进入到肿瘤细胞中包装出活体病毒，引发肿瘤细胞的凋亡，有效提高病毒溶瘤的功能。