本发明涉及一种检测诊断角膜营养不良致病基因的DNA文库及其应用，该文库包括24个角膜营养不良相关的致病基因，本发明优选24个角膜营养不良致病基因，设计探针池，建立针对24个角膜营养不良致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的24个基因检测区域能够检测包括上皮和上皮下角膜营养不良、前弹力层角膜营养不良、基质角膜营养不良、后弹力层及角膜内皮营养不良等多种常见角膜营养不良，对角膜营养不良的诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。