本发明涉及一种检测诊断多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因的DNA文库及其应用，该文库包括51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病的致病基因。本发明优选51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因，设计探针池，建立针对51个多发性牛奶咖啡斑致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据，具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的51个基因检测区域能够检测遗传性色素异常、Cowden综合征、共济失调性毛细血管扩张症、Noonan综合征等多种多发性牛奶咖啡斑相关疾病，对多发性牛奶咖啡斑的病因分析和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。