本发明公开了一种微生物发酵生产N‑乙酰氨基葡萄糖的方法，将大肠杆菌、酿酒酵母菌制得混合发酵剂接种至发酵培养基中恒温摇床培养，控制摇床转速230‑250rpm，培养温度为36‑38℃，发酵过程采用恒速补料方式进行，控制葡萄糖补料速度为3‑5g/L·h，用氨水控制发酵过程pH不小于6.9，当发酵液OD600nm大于30时，分批加入诱导剂IPTG和甲醇溶液，培养时间为35‑72h。本发明通过混合发酵剂提高大肠杆菌活性，并通过多种手段降低谷氨酸的累积速度，有利于实现产品高产量规模化生产。