本发明属于环保技术领域，涉及一种制备生物表面活性剂的方法。该制备生物表面活性剂的方法包括以下步骤：(1)对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)CGMCC No1.10452进行活化培养，得到种子液；(2)将所述种子液接种于发酵培养基，进行发酵培养，获得发酵液，从所述发酵液中提取所述生物表面活性剂；其中所述发酵培养基包括以下浓度的组分：20～50g/L的甘油；3～10g/L的酵母膏；5～10g/L的磷酸一氢盐；1～5g/L的磷酸二氢盐；0.04～0.1g/L的CaCl2；0.02～0.1g/L的FeSO4；以及0.10～0.5g/L的MgSO4·7H2O。本发明提供的制备生物表面活性剂的方法，采用膜分离技术分离产物中的生物表面活性剂，相对于酸沉淀和有机溶剂萃取，不会造成环境污染问题，适合工业化推广应用。